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样品到达域值水平所经历的循环数称为ct值(---点的循环数)。域值应设定在使指数期的扩增效率为较大,这样可以获得准确,可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品,线性回归分析将产生一条标准曲线,可以用来计算未知样品的浓度。
pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特---的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时, 探针结合在dna任意一条单链上;pcr扩增时,taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条dna链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。或者使用荧光染料sybr。sybr可以结合到双链dna上面,当体系中的模板被扩增时,sybr可以有效结合到新合成的双链上面,随着pcr的进行,结合的sybr染料越来越多,被仪器检测到的荧光信号越来越强,从而达到定量的目的。
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目前,采用荧光定量pcr检测技术可以对解脲支原体、人类瘤---、单纯---、肝的---、---、eb---和巨细胞---等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。如:菌基因诊断的意义主要表现在:a.区分tb;b.检测tb耐药基因;c.提高tb的阳性检出率。
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